Počítání retikulocytů v krvi

Pro provedení těchto studií je nezbytné následující vybavení pracoviště:

1. Snímky.
2. Pozemní skluzavky.
3. Mokrý fotoaparát.
4. Směšovače bílých a červených krvinek.
5. Brýle s měsícem.
6. Mikroskop
7. Brilantní modrá freska.
8. Absolutní ethylalkohol.
9. Methylalkohol nebo směs Nikiforova (stejné díly ethyl 96 ° alkoholu a etheru).
10. Gayemovo činidlo nebo 3% roztok stolní soli.
11. Ponorný olej.
12. Sada nástrojů pro vstřikování prstu.

V závislosti na struktuře látky s granulovanou mřížkou existuje pět typů retikulocytů: prášková, korneální, nekompletní, síťovaná a cívková (viz obrázek).

Různé skupiny retikulocytů podle zralosti

Užívání krve za účelem počítání retikulocytů v ní se provádí podle pokynů lékaře. Pro výpočet počtu retikulocytů se obarví. Pro tento účel použijte:

1. Metoda intravitálního (supravitálního) barvení retikulocytů.
2. Metoda současného supravitálního barvení krevních destiček a retikulocytů podle Alekseeva.

Zvažte tyto metody podrobněji.

Životnost (supravital) barvení retikulocytů

Tato metoda vyžaduje následující činidla:

1. Absolutní ethylalkohol: v suchém stavu se zazátkovanou zátkou se misky umístí na kalcinovaný bezvodý (bílý) síran měďnatý a nalije se 1/4 dílu absolutního alkoholu. Obsah je otřesen. Absolutní alkohol (alkohol, který neobsahuje vodu) může být získán dehydratací alkoholu se síranem měďnatým, předem kalcinovaným. Dehydratace se zastaví, když se sulfid mědi přestane modlit.
2. Nasycený brilantní krezylová modř v absolutním alkoholu: Do 80 ml absolutního alkoholu se přidá 1 g brilantně modrého půlměsíce.
3. Azur I.

Technika barvení in vivo a počítání retikulocytů

Sklíčka jsou předem potažena nasyceným roztokem brilantní krezylové modři. Na skleněném sklíčku se natírá čerstvě vytvořená kapka krve, jako při přípravě krevního nátěru. Lék se ihned umístí na 6-8 minut do vlhké komory, pak se suší na vzduchu a mikroskopicky (okulár 7X, 90X objektiv se zvýšeným kondenzátorem). Retikulocyty se počítají stejně jako destičky s omezovačem zorného pole. Retikulocyty, natřené briliantovou modří, bledozelené s modrým nebo modrým pletivem (viz obr.).

Retikulocyty barvené Brilliant-Cresyl Blue

Namísto brilantní modři se pro barvení retikulocytů může použít barvivo podle Magina, barvivo azur I (1 g azurového I na 40 ml absolutního alkoholu; inkubováno při pokojové teplotě po dobu 2 dnů).

Současné supravitální barvení krevních destiček a retikulocytů podle Alekseeva

Alekseevova barva se používá pro tuto metodu. V baňce o objemu 100 ml nalijte 1 g barviva Azur II a přidejte do reakční nádoby následující činidlo připravené v samostatné baňce: 5 g citrátu sodného, ​​4 g chloridu sodného a 45 ml destilované vody. Obsah baňky se pomalu zahřívá na azbestové síťce za stálého míchání bez varu. Cool, filtr. Filtrát se používá jako pracovní nátěrový roztok.

Technika současného barvení a počítání krevních destiček a retikulocytů

V mixéru pro leukocyty až po značku 1.0 je kreslena Alekevova barva, otřete hrot barvy a položte na stůl. Proveďte hlouběji, než je obvyklé vpich do prstu. Krev je odebírána až do 4/5 objemu rozšířené části mixéru, aby se do ní nedostaly vzduchové bubliny. Krev je rychle vyfouknuta z kapilární části mixéru na vatu a zbytek je vyfouknut do otvoru sklíčka. Z jamky se kapalina opět přivádí do míchačky. Dvojnásobné, trojnásobné opakování této manipulace míchá krev s činidlem. Po posledním shromáždění kapaliny v mixéru se kapalina ponechá v horizontální poloze po dobu 15-30 minut pro barvení retikulocytů a destiček. Směs se pak třepe jednu minutu a uvolní se 1-2 kapky. Z následných kapek připravte tenké tahy. Přípravky se suší na vzduchu, fixují se methylalkoholem a zbarví se Romanovským barvou v ředění 1-2 kapek na 1 ml vody po dobu 35-45 minut. Barva se promyje vodou a nátěry se suší a mikroskopicky se ošetří. V nátěru barveném podle Alekseeva jsou retikulocyty růžové s modrým oky (viz obr.) A destičky jsou modravě fialové.

Retikulocyty obarvené podle Alekseeva

Počítání retikulocytů a krevních destiček se provádí současně na 1000 červených krvinkách stejným způsobem, jaký je popsán v tématu „Destičky“. Výsledky retikulocytů jsou vyjádřeny v promille; krevní destičky se vypočítají na 1 mm3 krve (pro výpočet se vezme v úvahu počet erytrocytů počítaných u tohoto pacienta).

V krvi zdravých jedinců tvoří 5-10% retikulocytů.

Počítání retikulocytů v krevním nátěru

Supravitální barvení retikulocytů.

Detekce retikulocytové granulované retikulární látky při barvení briliantovou modrou bez předchozí fixace.

1% roztok brilantní krezylové modři: 50 mg barvy se rozpustí v 5 ml fyziologického roztoku a přidá se 20 mg citrátu sodného (roztok se skladuje v tmavé skleněné nádobě, vhodné na několik dní).

Na skleněné podložní sklíčko s otvorem vložte 2 kapky 1% roztoku kosočarově modré diamantové barvy a 1 kapku krve. Jemně promíchejte skleněnou tyčinkou a směs umístěte do vlhké komory (Petriho misky, ve které se lehce navlhčená gáza nebo vata umístí na okraje) po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Pak proveďte tahy a usušte.

V nátěrech jsou erytrocyty obarveny nažloutle zelenou barvou a granulovaná síťová látka v retikulocytech je zbarvena modře a fialově.

Mikroskopicky se rozmazává ponornou čočkou. Počítání retikulocytů se provádí na 1000 erytrocytech (při výpočtu 2000-3000 erytrocytů se získá větší přesnost).

Zvýšení počtu retikulocytů je pozorováno, když:

stimulace erytropoézy (ztráta krve, hemolýza, krize retikulocytů s úspěšnou léčbou B12-nedostatečné anémie, akutního nedostatku kyslíku).

Snížení počtu retikulocytů je pozorováno, když:

inhibice erytropoézy (aplastická a hypoplastická anémie, neléčená B12-nedostatečná anémie, rakovinové metastázy v kostech),

onemocnění ledvin, endokrinní onemocnění.

Zvýšení retikulocytů v periferní krvi (retikulocytóza) je zaznamenáno: • s hemolytickou anémií (počet retikulocytů může dosáhnout 60% nebo více (zejména během hemolytických krizí); • s akutní ztrátou krve (3–5 dnů po ztrátě krve dochází k retikulocytární krizi) včetně zvýšení retikulocytů umožňuje podezření na latentní krvácení (například u pacientů s peptickým vředovým onemocněním gastrointestinálního traktu, tyfusovou horečkou), • u malárie, • při polycytemii, • při léčbě železem s nedostatkem železa. anémie (několik dní (3–10) po zahájení antianemické léčby zhoubné anémie), • akutní nedostatek kyslíku, • nádorové metastázy v kostní dřeni, je třeba mít na paměti, že v případě zvýšené destrukce červených krvinek může podíl retikulocytů překročit 50% z důvodu umělého poškození. nadhodnocení počtu retikulocytů (jak již bylo zmíněno dříve, podíl retikulocytů je vypočten v% všech červených krvinek). V takových případech se „retikulární index“ používá k odhadu závažnosti anémie, která se vypočítá podle vzorce: ocyty x hematokrit) / 45 x 1,85, kde 45 je normální hematokrit, 1,85 je počet dnů potřebných pro vstup nových retikulocytů do krve. Pokud je index 2-3, pak dochází ke zvýšení tvorby červených krvinek. Pravá retikulocytóza: zvýšení počtu retikulocytů v periferní krvi se současným zvýšením počtu retikulocytů v kostní dřeni. Falešná retikulocytóza: nedostatek zvýšeného počtu retikulocytů v kostní dřeni se zvýšením jejich počtu v periferní krvi (což naznačuje zvýšení vyluhování retikulocytů z kostní dřeně do periferní krve). Faktor, který vede ke zvýšení obsahu retikulocytů, může být následující: kortikotropin, antimalarická léčiva, antipyretika, furazolidon (u malých dětí), levodopa. Pamatujte: retikulocytóza, bez odpovídající erytromyofoblastické reakce kostní dřeně, je pozorována, když jsou některé oblasti podrážděny rakovinovými metastázami nebo zánětlivými ložisky. Možnou chybou ve výpočtu retikulocytů může být jejich falešné nadhodnocení v důsledku přítomnosti: • inkluzí v červených krvinkách (Jolly tele, parazity malárie); • vysoká leukocytóza; Abnormální forma hemoglobinu; • hyperthrombocytóza; • obří destičky. Je pozorován pokles v počtu nebo nepřítomnosti retikulocytů (retikulocytopenie): • s generací aplastických a hypoplastických anemií; • s anémií způsobenou nedostatkem železa, vitamínem B12, kyselinou listovou (mikrocyto-hypochromní a megaloblastickou anémií); • s talasémií; • s sideroblastickou anémií; • u nádorových metastáz v kostech; • s radiační nemocí a radiační terapií; • při léčbě cytostatik; • při autoimunitních onemocněních hematopoetického systému; • onemocnění ledvin; • s alkoholismem; • s opakovaným výskytem anémie z Addison-Birmer; • s myxedémem. Faktory narušující výsledek laboratorního výzkumu obsahu retikulocytů: • nesprávná volba antikoagulantu nebo nedostatečné promíchání krve s antikoagulantem; • prodloužené mačkání paže šňůrkou; • příjem sulfonamidů (možné jsou nízké i vysoké výsledky); • krevní transfúze krátce před studií; • hemolýza krevního vzorku. Indikace pro testování retikulocytů: • hodnocení aktivity erytropoézy v podmínkách doprovázených hemolýzou nebo ztrátou krve; • hodnocení schopnosti kostní dřeně regenerovat se po cytotoxické terapii a transplantaci kostní dřeně; • hodnocení regenerace syntézy erytropoetinu po transplantaci ledvin; • dopingová kontrola u sportovců (užívajících erytropoetin); • diagnóza neúčinné hemopoézy nebo snížení produkce červených krvinek; • diferenciální diagnostika anémie; • detekce zhoršené regenerační kapacity kostní dřeně s nedostatkem železa, vitamíny B12, B6, folátem, mědí a monitorováním vhodné terapie; • hodnocení odpovědi na léčbu erytropoetinem, erytropopresory.

METODY VÝPOČTU RATIKULOCYTŮ

(1) Spočítání počtu retikulocytů v nátěru po barvení speciálními barvivy. Tato metoda je v praxi nejpoužívanější metodou vzhledem k tomu, že je jednoduchá, poměrně levná a nevyžaduje speciální drahé zařízení, a proto může být použita v jakékoliv klinické diagnostické laboratoři. Princip metody je založen na detekci retikulocytární granulované retikulované látky s suvoraitálním barvením alkalickými barvivy (nasycený roztok kosočtverelové modři v absolutním alkoholu / azurovém roztoku I / azurovém roztoku II) s dalším počítáním v krevním nátěru. Barvení retikulocytů se provádí buď na skle nebo ve zkumavce. Výpočet se provádí pomocí mikroskopu: připraví se jedním z výše uvedených způsobů, šmouhy se mikroskopicky podrobí imerznímu cíli; ve stěrku jsou retikulocyty a erytrocyty zbarveny nažloutlezelenou granulární vláknitou látkou v retikulocytech - modře (pokud jsou obarveny azurovým II a brilantně modrou krystalovou modří) nebo modravě fialovou (pokud jsou zbarveny azurovým I). (2) Počítání počtu retikulocytů za použití fluorescenční mikroskopie. Tato metoda je jednoduchá a vyžaduje málo času, přesnější než obvyklá metoda, protože fluorescenční mikroskopie odhaluje nejmenší zrna materiálu s vláknovými vlákny, ale je možná pouze s fluorescenčním mikroskopem a speciálními barvivy, a proto je k dispozici pouze několik laboratoří.. Princip počítání počtu retikulocytů za použití fluorescenční mikroskopie je založen na použití schopnosti látky retikulocytů fluoreskovat po léčbě krve akridinovou oranžovou. Krev se smíchá s akridinovým pomerančem v zkumavce nebo mixéru v poměru 1 díl krve a 10 dílů barvy (směs může být skladována maximálně 5 hodin). Směs se míchá po dobu 2 minut, na skleněnou sklíčko se nanese kapka směsi a zakryje se krycím sklem. V tomto případě by kapalina neměla přesahovat krycí sklo. Mikroskop s použitím filtru ZhS-17. V preparátu mají erytrocyty tmavě zelené obrysy a nefluoreskují a v retikulocytech granulární síťová látka svítí jasně červeně, což umožňuje snadné počítání retikulocytů. V krvi, stabilizované heparinem nebo citrátem sodným, není pozorována fluorescence retikulocytů. (3) Automatické počítání retikulocytů pomocí hematologického analyzátoru. V moderních hematologických analyzátorech je technologie počítání krevních buněk založena na metodě konduktometrie, kterou navrhl H. Wallace a Joseph R. Culter v roce 1947. Principem metody je spočítat počet a určit povahu pulzů, ke kterým dochází, když buňka projde otvorem o malém průměru (clona), na obou stranách jsou umístěny dvě elektrody izolované od sebe. Každý průchod článku skrz otvor je doprovázen výskytem elektrického impulsu, který je zaznamenán elektronickým senzorem. Rozdělení buněk do kategorií (erytrocyty, leukocyty, krevní destičky, sedimenty) se provádí přístrojem na základě analýzy amplitudy přijatých pulzů, pro stanovení buněčné koncentrace stačí projít určitý objem vzorku kanálem a spočítat počet generovaných pulzů. Je třeba poznamenat, že kromě klasického parametru retikulocytů - relativního (%) obsahu retikulocytů (RET%, procento retikulocytů), stanoveno pomocí 1 a 2 metod laboratorní diagnostiky, díky nástupu high-tech hematologických analyzátorů (3 metody) získat (například použitím patentovaného fluorescenčního barviva pro analyzátor Sysmex -XT-2000i) další informativní parametry retikulocytů: • retikulocyty s nízkým obsahem RNA, nejzralejší (LFR%, retikulocyty s nízkou fluorescencí) frakce, frakce retikulocytů s nízkou fluorescencí); • retikulocyty s průměrným obsahem RNA (MFR%, střední fluorescenční frakce retikulocytů) (frakce retikulocytů s průměrnou fluorescencí); • retikulocyty s vysokým obsahem RNA (HFR%, frakce retikulocytů s vysokou fluorescencí) - zlomek retikulocytů s vysokou fluorescencí); • Nezralá frakce retikulocytů (IRF%, nezralá frakce retikulocytů). Diferenciace retikulocytů na základě stupně zralosti a tedy obsahu nukleových kyselin je odrazem hematopoetické aktivity kostní dřeně. Technika (analyzátor Sysmex-HT-2000i). V průtočné komoře buňky procházejí polovodičovým laserovým paprskem, v tomto případě je paprsek rozptýlen ve velkých a malých úhlech a fluorescenční barvivo je excitováno. To vám umožní určit různé stupně zralosti retikulocytů na obsah RNA v buňkách a intenzitu jejich luminiscence. Automatické počítání retikulocytů je vysoce přesné (počítá se více než 30 000 erytrocytů) a reprodukovatelnost (variační koeficient je asi 6%). Tato technologie poskytuje přesné počítání retikulocytů i při extrémně nízkých koncentracích.

Retikulocytopenie a retikulocytóza, příčiny vývoje, diagnostická hodnota jejich detekce.

Retikulocyty (retikulocytus)

Retikulocyty jsou mladé červené krvinky, které vznikají po ztrátě jader normoblasty.

Charakteristickým rysem retikulocytů je přítomnost granulované síťové substance, která se projevuje supravitálním barvením, tj. Bez předchozí fixace buněk.

Elektronově mikroskopicky bylo prokázáno, že struktury zrnité sítě jsou zbytky endoplazmatického retikula, ribozomů a mitochondrií obsahujících RNA. Protein (globin), hem, puriny, pyrimidinové nukleotidy, fosfatidy, lipidy jsou lehce syntetizovány v retikulocytech, ale RNA v nich není syntetizována. Během 2 dnů zůstává retikulocyt v krevním řečišti, po kterém se, jak se snižuje RNA, stává zralým erytrocytem.

U nátěrů obarvených konvenčními hematologickými metodami jsou šedavě růžové retikulocyty polychromatofilní, tzn. malované různými barvivy.

V současné době je používán jednotný způsob počítání počtu retikulocytů po jejich barvení.

• kosočtverec modrý,
• Azure I nebo
• Azure II přímo na skle nebo ve zkumavce.

1. Princip metody

Identifikace granulované síťoviny erytrocytů barvením alkalickými barvami s jejich dalším počítáním v krevním nátěru.

2. Činidla:

a) nasycený roztok brilantní krezylové modři v absolutním alkoholu (pro přípravu absolutního alkoholu musí být 96% ethanol uchováván v několika změnách práškového síranu měďnatého): 1,2 g barvy na 100 ml alkoholu;

b) roztok azurového I: azurový I - 1 g, oxalát amonný - 0,4 g, chlorid sodný - 0,8 g, 96% ethylalkohol - 10 ml, destilovaná voda - 90 ml. Roztok barvy v uzavřené lahvičce se umístí na 2-3 dny do termostatu při 37 ° C a periodicky se silně třepe. Potom se ochladí na teplotu místnosti a filtruje se přes filtrační papír. Roztok je uložen v misce z tmavého skla. Když se objeví sraženina, barva by měla být znovu přefiltrována;

c) Roztok Azure II: Azur II - 1 g, citrát sodný - 5 g, chlorid sodný - 0,4 g, destilovaná voda - 45 ml. Roztok se ponechá v termostatu při 37 ° C po dobu 2 dnů za občasného míchání. Pro urychlení rozpouštění může být barva zahřívána na nízké teplotě po dobu 15–20 minut bez varu. Ochlaďte na teplotu místnosti a přefiltrujte. Skladujte v misce z tmavého skla.

3. Zbarvení

Barvení na skle:

• Nad plamenem hořáku se zahřeje dobře promyté a odtučněné sklíčko. Pomocí skleněné tyčinky se na sklo položí kapka jednoho z barviv a připraví se nátěr z mletého skla. Označte stranu skla, na které se nanáší nátěr, skleněným vláknitým grafem. V této formě může být sklo připraveno pro skladování a skladováno na suchém tmavém místě;
• na takto připravené brýle položili kapku krve, udělali tenký nátěr a ihned umístili sklo do vlhké komory. K tomu použijte Petriho misku s víkem, ve které jsou hrany mírně navlhčeny válečky z gázy nebo bavlny;
• stěrky se uchovávají po dobu 3-5 minut ve vlhké komoře a pak se suší na vzduchu. Granulovaná retikulární látka retikulocytů je zbarvena do fialově modré barvy a jasně se odlišuje od zeleno-modravého pozadí erytrocytů.

Barvení in vitro:

• metoda 1: před použitím připravte zkušební roztok diamantu krezylové modři na zkumavku na základě kapky 1% roztoku oxalátu draselného 4 kapky roztoku barvy 1. Přidejte 40 μl krve do barviva (dvě pipety na značku 0,02). Směs se důkladně, ale opatrně míchá a nechá se 30 minut. Míchejte a připravte tenké tahy;
• Metoda 2: 0,05 ml roztoku barvy 3 a 0,2 ml krve se umístí do zkumavky. Směs se důkladně promísí a nechá se 20 až 30 minut. Míchejte a připravte tenké tahy;
• Metoda 3: 0,3–0,5 ml roztoku barvy 2 a 5–6 kapek krve se vloží do zkumavky s pipetou z přístroje Panchenkov. Zkumavka se uzavře pryžovou zátkou, směs se důkladně, ale opatrně promíchá a nechá se 1–1½ h (retikulocyty jsou lépe obarveny expozicí 1½ h –3 h). Míchejte a připravte tenké tahy.

4. Počítání retikulocytů

U šmouh jsou erytrocyty zbarveny nažloutlezelenou, granulovaná vláknitá látka je modrá nebo modravě purpurová.

• Připravené jedním z výše uvedených způsobů se skvrny mikroskopicky skenují pomocí imerzní čočky;
• Je nutné počítat nejméně 1000 červených krvinek a mezi nimi zaznamenat počet červených krvinek obsahujících granulovanou vláknitou látku. S jednotnými tenkými tahy, ve kterých jsou červené krvinky uspořádány v jedné řadě, vybírají zorné pole, ve kterém je například 50 červených krvinek, a pak vypočítá 20 takových zorných polí;
• prakticky pro větší přesnost se používá speciální okulár, ve kterém lze zorné pole zmenšit na požadované rozměry. V nepřítomnosti hotového okuláru, to může být snadno připraveno odšroubováním okuláru × 7, dávat kus papíru s malým čtvercem řezaným do toho a šroubovat to. Počet počítaných retikulocytů je vyjádřen na 1000 nebo na 100 erytrocytů.

RATE: 0,5–1,2% (30–70 × 109 / l)

Zvýšení počtu retikulocytů je pozorováno, když:

• ztráta krve (zvláště akutní);
• hemolytickou anémii, zejména během krize (až 20-30%);
• během léčby megaloblastické anémie s vitamínem B12 (retikulocytární krize - zvýšení počtu retikulocytů ve 4. - 8. den léčby).

Snížení počtu retikulocytů je typické pro:

• aplastickou a hypoplastickou anémii;
• neošetřená megaloblastická anémie;
• radiační nemoc;
• užívání cytotoxických léků.

Je Kristus naživu? Vzkřísil Kristus z mrtvých? Výzkumníci studují fakta

Rychlost a počet retikulocytů

Retikulocyty krevních buněk, jejichž rychlost se mění v závislosti na mnoha faktorech, jsou netvarované formy červených krvinek a mohou být detekovány v kostní dřeni a v periferní krvi. Zpravidla retikulocyty v krvi zrají za tři až pět dnů a pak se tyto buňky promění v již zralé červené krvinky. Kromě toho je počet nevytvrzených erytrocytů u novorozenců významně vyšší než u dospělých.

Identifikace retikulocytů, jejichž rychlost se stanoví pomocí speciální tabulky, je třeba vzít v úvahu jejich rozdíly od zralých erytrocytů. V této řadě krevních buněk je obsaženo buď celé jádro, nebo jsou jeho zbytky pozorovány ve složení granulární vláknité látky. Pro identifikaci počtu těchto buněk je nutné studovat barvu krevního nátěru v laboratorních podmínkách. K tomu použijte modrý diamantový roztok, který se aplikuje na skleněné a předem promyté sklo, a poté se vytvoří nátěr.

Když jsou detekovány retikulocyty, jejichž rychlost je odlišná, ihned po nátěru by mělo být použité sklo umístěno do Petriho misky - speciální vlhké komory, pak ponecháno stát po dobu pěti minut, důkladně vysušeno na čerstvém vzduchu a poté mikroskopováno. Kromě toho je látka typu granulovaného vlákna uvnitř retikulocytu obvykle natřena fialově modrým odstínem a pozadí erytrocytů se vyznačuje modravě zeleným odstínem.

Pokud je použita metoda Gel-Meier, barva nezralých krvinek může být pozorována mnohem lépe, ale to vyžaduje Vidalovu trubici. V této nádobě se několik kapek krve smísí s diamantovým roztokem a chloridem sodným, pak se zkumavka uzavře víčkem a samotný nátěr se provede za hodinu.

Při výpočtu počtu nezralých krvinek je třeba jako základ vzít 1000 erytrocytů a poté zvážit retikulocyty, jejichž rychlost se obvykle pohybuje na úrovni 0,2% -1,2% počtu dospělých erytrocytů. V průměru je u většiny lidí počet nezralých červených krvinek obvykle 0,7% z celkového počtu zralých krvinek. Pokud je počet retikulocytů nad maximální přípustnou rychlostí 10% nebo vyšší, má osoba retikulocytózu - onemocnění doprovázené pravidelným akutním krvácením a hemolytickou anémií.

Počítání retikulocytů (norma u dětí je obvykle vysoká), stojí za to vidět, že jejich počet nepřekračuje mezní hodnoty charakteristické pro dospělé. Standardy také závisí na pohlaví, protože u žen je 2,07% nezralých červených krvinek stále považováno za platný parametr, u mužů by tento ukazatel neměl překročit 1,92%.

V případech, kdy je hladina retikulocytů významně zvýšena, to indikuje přítomnost takových poruch v těle, jako je malárie a talasemie, polycytémie a hypoxie, anémie, všechny druhy hemolytických syndromů, ale tyto indikátory jsou možné při léčbě kyanokobalaminu. Pokud je hladina nezralých erytrocytů snížena, může se u člověka objevit aplastická a hypoplastická anémie, všechny druhy onemocnění ledvin a myxedémů, stejně jako šíření kostních metastáz na kosti.

Pro diagnostiku závažnosti anémie je nutný „retikulocytární index“, který se vypočítá jako poměr procentuálního podílu retikulocytů a normálních hodnot hematokritu násobených počtem dnů potřebných pro příjem nezralých buněk do periferní krve. Pokud výsledný index nepřesáhne dva, indikátor indikuje hypoproliferativní složku anémie a v případě dvou překročení indikuje pravděpodobnost zvýšené tvorby červených krvinek.

Krevní test Krevní test

Stanovení koncentrace hemoglobinu

Mezi metodami pro stanovení hemoglobinu jsou nejrozšířenější metody založeny na kolorimetrii, tj. Na stanovení intenzity barev, z nichž nejjednodušší je stanovení hemoglobinu pomocí vizuální kolorimetrie v hemometru Sali, což je dřevěný stativ se střední odměrnou zkumavkou, na jejímž stranách je uzavřené skleněné zkumavky jsou opatřeny barevným standardem (hydrochlorid hematinu v glycerinu) a do centrální zkumavky se nalije 0,1% roztok kyseliny chlorovodíkové šarže až po značku odpovídající 2 nebo 3 g%, pak opatrně přidejte (přesně!) 0,02 ml krve odebrané z prstu speciální pipetou připojenou k hemometru. Povrchová vrstva kyseliny se promyje pipetou a smíchá se skleněnou tyčinkou a krví a kyselinou a ponechá se po dobu 5 minut za vzniku hydrochloridu hematinu. Pak přidáním destilované vody a neustálým mícháním tyčinkou dosáhnete úplného sladění barvy kapaliny v centrální trubce se standardy. Koncentrace hemoglobinu odpovídá hladině roztoku v dolním menisku. Koncentrace hemoglobinu může být vyjádřena buď v g% hemoglobinu nebo v libovolných jednotkách. 16,67 g hemoglobinu bylo odebráno jako 100 jednotek.

Koncentrace hemoglobinu v krvi žen je od 11,7 do 15,8 g / o nebo od 117 do 158 g / l, u mužů od 13,3 do 18 g% nebo od 133 do 180 g / l.

Odběr krve pro jednotné počítání

Pro výpočet jednotných prvků se krev zředí v míchačkách (melangeres) nebo zkumavkách, které se v poslední době rozšířily a pro stanovení počtu červených krvinek se krev zředí 200krát 3% roztokem chloridu sodného; při odběru krve používáme pipetu z hemometru, jehož objem je 0,02 ml, pak musíme odebrat 4 ml roztoku chloridu sodného, ​​pro počítání leukocytů se krev zředí 20krát, proto se odebere 0,02 ml krve a 0,38 ml 3%. tónovaný roztok kyseliny octové methylenové modři, který je nezbytný pro destrukci červených krvinek, krev musí být odebrána s velkou přesností, protože u takových malých objemů vede vzduchová bublina nebo krevní zbytek na vnější straně pipety ke zvýšení chyby stanovení. Vyplněním komory je nutné otřít leštěné sklo v komoře tak, aby se objevily duhové prstence, před naplněním komory se zředěná krev důkladně promísí, jak se buňky usadí na stěnách zkumavky nebo ampule mixéru, poté se kapka krve pod mletým broušeným sklem v komoře opouští a nechá se 1 min. zbytek pro buněčnou sedimentaci.

Výpočet tvarovaných prvků se provádí při malém zvětšení mikroskopu (objektivu 8X, okuláru 15X nebo 10X) v tmavém zorném poli.

Červené krvinky se počítají v 5 velkých čtvercích (16x5 = 80 malých čtverečků) umístěných v různých částech komory, diagonálně umístěných čtverečků, červených krvinek ležících uvnitř čtverce a na horních a levých stranách jsou počítány; RBC ležící na spodní a pravé straně se nepočítají, protože patří k jiným čtvercům.

Spočítáním počtu erytrocytů (A) v 5 velkých čtvercích se aritmetický průměrný počet erytrocytů nachází v jednom malém čtverci A / 80, tj. V 1/4000 ul. Abychom tedy našli počet červených krvinek v 1 μl, musíme vynásobit počet získaný dělením 4000 a 200 (ředění).

Dostáváme tedy následující vzorec:

kde X je počet erytrocytů v 1 μl, a A je počet erytrocytů v 5 velkých čtvercích, pokud jsme považovali erytrocyty v 5 velkých čtvercích a bred krvi 200 krát, pak společným faktorem pro číslo A bude 10 000.

Normální obsah červených krvinek v krvi žen je 4-5 * 106, muži - 4,5-5,5 * 106.

Leukocyty se počítají ve 100 velkých čtvercích, které nejsou rozděleny na malé, což odpovídá 1600 malým. Počet leukocytů na 100 čtvercích se dělí 1600, násobí 4000 a 20 (ředění). V tomto případě, aby se dosáhlo výsledku, je počet spočítaných leukocytů dostatečný pro násobení 50. Normální obsah leukocytů v krvi je 5 x 103 - 8 x 103 v 1 μl.

Barevný indikátor krve. Ukazatel barvy krve označuje číslo, které udává, jaká je průměrná saturace hemoglobinu jednotlivých erytrocytů dané krve ve srovnání se saturací jednotlivých erytrocytů normální krve, 100 jednotek má normální obsah hemoglobinu a normální počet červených krvinek je 5 000 000. Barevný index zdravých lidí se liší od 0,9 do 1,1 Vyšetření periferní krve. Morfologie erytrocytů je studována v krevních nátěrech a zvažuje se vzorec leukocytů, tj. Procentuální poměr mezi různými typy leukocytů, aby byla studie úspěšná, musí být s velkou opatrností provedena příprava, fixace a zbarvení krevních nátěrů. ve vzdálenosti 0,5 cm od okraje sklíčka se dotkněte kapky krve v místě vpichu na prstu a potom rozkryjte krycí sklíčko pod úhlem 45 ° k skluzu a přeneste první do kapky krve tak, že se šíří na zadní hranu krycího sklíčka a lehký pohyb, bez ostrého tlaku, vytváří nátěr. Šmouha by měla na sklíčku končit „koštětem“. Stěr se suší na vzduchu, když je suchý, dobrý, tenký nátěr má žlutou barvu.

Jednoduchá, ostře naostřená tužka uprostřed stěrky zapíše jméno pacienta a datum studie, poté se stěrky fixují v methylalkoholu po dobu nejméně 5 minut a natřou podle metody Romanovského-Giemsa.

Barva se skládá ze směsi kyselých (eosinových) a základních (Azur II) barviv. Tato metoda barvení umožňuje diferencovat buňky. Prvním krokem při práci s nátěrem je vyhodnocení morfologie erytrocytů. K tomu zvolte tenké místo, kde buňky leží odděleně, a nikoli ve formě sloupců mincí. Normální erytrocyty jsou buňky bez jader, růžově zbarvené, zaoblené, přibližně stejného průměru - 7,5 μm, erytrocyty mají tvar bikonkávního disku, proto mají ve stěrku osvícení ve středu a intenzivněji zbarvenou periferii.

Vaření tlusté blob

Při krevních testech na plazmidech vytváří malárie tlustý pokles. Krev odebraná obvyklým způsobem z dužiny prstu. K kapce krve vyčnívající z místa vpichu se dotkněte povrchu skleněného sklíčka. Aplikuje se samostatně, 2-3 kapky rozmazávají roh dalšího skla. Suchý nátěr se nalije (bez fixace) nátěrem Romanovsky po dobu 30-40 minut, poté se opatrně opláchne vodou a přípravek se vysuší ve vzpřímené poloze.

Data analýzy vzorků

Zvýšený počet červených krvinek a hemoglobinu v krvi může být způsoben onemocněním červených elementů krve - erytrémií, pak počet červených krvinek dosahuje 9-106 a více.Zvýšený obsah červených krvinek v krvi se může objevit znovu, tj. Když nedochází k onemocnění červených krvinek, a počet erytrocytů se zvyšuje v důsledku onemocnění jiných orgánů a systémů (s dekompenzovanou difuzní pneumosklerózou, plicním emfyzémem, určitými typy vrozených srdečních vad, vaskulární sklerózou plicního systému, vady pravého srdce, oběhové selhání stupně III atd.). Tento příznak se nazývá erytrocytóza.

Morfologicky změněné erytrocyty se objevují u hyperchromní (megaloblastické) anémie. Současně se v krvi nacházejí velké červené krvinky s vysokým obsahem hemoglobinu (makrocyty), fetální erytrocyty (megaloblasty), které se obvykle nevyskytují v periferní krvi. Morfologie erytrocytů se také mění s hypochromní anémií: objevují se malé erytrocyty (mikrocyty), modifikované ve tvaru (poikilocyty) a erytrocyty s nízkým obsahem hemoglobinu (hypochromní erytrocyty).

Počet leukocytů

Při výpočtu vzorce leukocytů je nezbytné určit strukturní znaky cytoplazmy a buněčných jader. Příslušnost buňky k jedné nebo druhé skupině je určena na základě souhrnu všech znaků cytoplazmy a jádra, při výpočtu vzorce by se mělo postupovat stejným způsobem, jakým se sklo pohybuje pod mikroskopem. Nejčastěji používaná metoda mikroskopie na 4 místech stěr. Je známo, že leukocyty jsou nerovnoměrně rozloženy ve stěrku: na okrajích je méně lymfocytů než ve středu a více monocytů na konci nátěru než na začátku. Proto je při výpočtu vzorce leukocytů nejvhodnější pohybovat se podél přerušované čáry, počítat všechny nalezené buňky Počet praktických 200 buněk je praktickým minimem pro běžné klinické studie Periferní krevní leukocyty se dělí na granulocyty (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní) v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti granularity a agranulocyty (monocyty a lymfocyty).

Neutrofily. Velikost buněk 10-12 mikronů. Cytoplazma buněk je světle růžová barva s jemným, bohatým, fialově zbarveným zrnem. Normálně, tam jsou bodnutí (2-4%) a segmentované (60-65%) neutrofily v krvi.

Eosinofily. Velikost buněk je stejná jako u neutrofilů, někdy o něco větší, cytoplazma je plná velkých žlutavě červených granulí, jádro má obvykle dva segmenty stejné velikosti. Eozinofily obvykle 2-4%, bazofily. Ve velikosti je nejmenší granulocyt. Jádro je nepravidelný, mnohokruhový, zabírá téměř celou buňku a světle růžová cytoplazma obsahuje velké tmavě fialové granule. Granule Basophil se rozpouštějí ve vodě a někdy jako výsledek promývání při barvení léčiva se místo granulí ponechají bezbarvé buňky. U normálních bazofilů 0,1%. Velikost buněk se pohybuje od 7 do 10 mikronů. Jádro kompaktní struktury, kulaté nebo ve tvaru fazole. Cytoplazma buněk je světle modrá se zónou osvícení kolem jádra (perinukleární), někdy v cytoplazmě jsou oddělená azurofilní zrna červenofialové barvy. V periferní krvi, normální 20-35% lymfocytů, Monocyty. Velikost buněk se pohybuje od 12 do 20 mikronů. Jádro je často podkovy, někdy nepravidelného tvaru. Cytoplazma je rozsáhlejší než u lymfocytů, popelově modré barvy s jemným, jemným, načervenalým zrnem.

Zvýšené hladiny leukocytů v krvi se nazývají leukocytóza a nízký krevní obraz se nazývá leukopenie.

Barvení a počítání retikulocytů

Retikulocyty jsou mladé červené krvinky s tenkou modrou sítnicí nebo zrnitostí v cytoplazmě. Tyto buňky charakterizují aktivitu tvorby červených krvinek, pro stanovení počtu retikulocytů používají metodu supravitálního (intravitálního) barvení. Na skleněných podložních sklíčkach se vyrobí nátěr brilliantcresylblau barvy v absolutním alkoholu a poté se na skleněnou fólii nanese krevní nátěr, který se uloží do vlhké komory po dobu 3-5 minut, poté se suší a mikroskopicky se snímá imerzní čočkou. Normálně se 1 000–8 000 erytrocytů nachází v 8–10 retikulocytech a jejich počet se obvykle vyjadřuje v procentech (0,8–1%) nebo v dílech na milion (8–10% o) vzhledem k erytrocytům. Retikulocyty jsou buňky, které charakterizují zvýšenou produkci erytrocytů v buňkách. kostní dřeň.

Objevují se ve velkém procentu v periferní krvi pro hypochromní anémii („maligní anémii“), pro hemolytickou anémii a další onemocnění. Během exacerbace hyperchromní anémie je pozorován snížený obsah retikulocytů a jejich úplné vymizení v periferní krvi.

Aby se zabránilo agregaci (lepení) krevních destiček, propíchnutí kůže se provádí kapkou 14% roztoku síranové magnézie aplikované na prst. Krev se smísí s magnezií a na sklíčkach se připraví tenké šmouhy, které se pak fixují a obarví podle Romanovského po dobu 2 hodin, stanoví se počet krevních destiček na 1000 červených krvinek a se spočítáním počtu červených krvinek v 1 μl se zjistí počet červených krvinek v 1 μl krve. Normální krevní destičky obsahují od 250 000 do 400 000.

Zvýšení počtu krevních destiček se vyskytuje u erytrémií, u onemocnění sleziny, u některých forem maligních onemocnění (například pankreatu). K nízkému počtu krevních destiček dochází při anémii.

Stanovení ESR

Rychlost sedimentace erytrocytů se stanoví v krvi smíchané v poměru 4: 1 s citrátem sodným, Reakce se umístí do přístroje Panchenkov. Panchenkovova kapilára se promyje citrátem sodným, poté se citrát sebere až po značku 50, kde písmeno P (činidlo) stojí a vyfoukne se do Vidalovy zkumavky. Stejná kapilára odebírá krev dvakrát na značku K (krev) a promíchá se s citrátem. Směs se smísí s citrátem, krev se naplní do stejné kapiláry před dělením 0 a umístí se svisle do stativu na hodinu. Za hodinu je velikost plazmatické kolony vytvořené nad usazenými erytrocyty zaznamenána v milimetrech, což je míra rychlosti sedimentace erytrocytů, u normálních ESR u mužů je to 10 mm / h, u žen 14 mm / h.

Rychlost sedimentace erytrocytů se zvyšuje se zánětlivými, akutními a chronickými onemocněními, se zhoubnými nádory a dalšími onemocněními.

Test kompatibility Rhesus

Ve zkumavce bez citrátu se odeberou 2-3 ml krve příjemce, po srážení krve se sraženina obklopí skleněnou tyčí a krev se odstředí. Dvě kapky séra z této zkumavky se nanesou na Petriho misku, přidá se kapka krve dárce, promíchá se a šálek se umístí do vodní lázně (42-45 ° C). Po 10 minutách se šálek odstraní a pozoruje se ve světle s mírným kroutením. Vzhled aglutinace indikuje nepřípustnost transfúze této krve.

Retikulocyt

Retikulocyty jsou mladé červené krvinky vytvořené po ztrátě jader normoblasty. Charakteristickým rysem retikulocytů je přítomnost granulární vláknité látky v cytoplazmě představující agregované ribozomy a mitochondrie. Tato látka je detekována speciální metodou barvení - supravital (intravital), tj. Bez předchozí fixace buněk. Granulární vláknitá látka v různých retikulocytech se odlišuje polymorfismem; čím mladší buňka, tím hojnější je substance. U nejmladších retikulocytů má formu tlusté cívky, ve zralejších buňkách je detekován ve formě retikula, jednotlivých vláken a pak jednotlivých zrn. U nátěrů obarvených konvenčními hematologickými metodami jsou šedavě růžové retikulocyty polychromatofilní, tj. Obarvené různými barvivy.

Počet retikulocytů se stanoví mikroskopicky speciálně zbarvených nátěrů.

3.2.1 Metody barvení krevních buněk na retikulocytech podle Alekseeva (počítáno podle Fonio)

Princip: Metoda je založena na počítání počtu retikulocytů v barvených krevních nátěrech na 1000 červených krvinek. Současně připravte 2 tampony (destičky a retikulocyty).

Reagent: pracovní nátěrový roztok podle Alekseeva

Postup detekce: Pracovní roztok se vyjme na značku 0,75 μl v kapiláře, aby se určila ESR, a plná krevní kapilára z punkcí prstu pacienta. Poměr barviva k krvi je 1: 4. Směs se nechá stát 2 hodiny, poté se na sklíčku nanese tenký nátěr. Šmouha se suší na vzduchu a mikroskopicky s ponořením.

Počítání se provádí následujícím způsobem: retikulocytové mřížky jsou zbarveny modře. Při počítání červených krvinek v zorném poli zvažte počet retikulocytů. Počítá se 1000 červených krvinek. Výsledek je vyjádřen v procentech.

Regulační hodnota: V krvi zdravého člověka obsahuje 0,2-1,0%

(nebo 2-10 až 12 ppm jsou povoleny) retikulocyty

Klinická a diagnostická hodnota: Vzhled retikulocytů v periferní krvi indikuje silnou práci kostní dřeně a používá se při hodnocení různých typů anémie.

Zvýšení počtu retikulocytů je pozorováno po ztrátě krve s hemolytickou anémií

Prudká retikulocytóza - pozorovaná hemolytickou žloutenkou

Snížení počtu retikulocytů v přítomnosti anémie indikuje aplastický typ tvorby krve.

Podle hladiny retikulocytů v krvi se anémie dělí na:

- regenerativní (počet retikulocytů 0,5–5% je posthemoragická anémie);

- hyperregenerativní (počet retikulocytů více než 5% je hemolytická anémie);

- hypo - a areregenerativní (počet retikulocytů je snížen nebo chybí, navzdory těžkému průběhu anémie - hypo - a aplastické, železo - a B12 - nedostatečná anémie).

Počítání retikulocytů v nátěru po barvení speciálními barvivy

Počítání retikulocytů v nátěru po jejich barvení speciálními barvivy je v praxi nejpoužívanější metodou počítání počtu retikulocytů. To je způsobeno tím, že metoda je jednoduchá, poměrně levná a nevyžaduje speciální drahé zařízení, a proto může být použita v jakékoliv klinické diagnostické laboratoři.

Princip metody

Detekce retikulocytové granulované retikulární látky se supravitálním barvením alkalickými barvivy s dalším počítáním v krevním nátěru.

Činidla

Můžete použít jedno z následujících barviv:

1. Nasycený roztok brilantní krezylové modři v absolutním alkoholu (pro přípravu absolutního alkoholu, 96% ethanolu musí zestárnout v několika změnách práškového síranu měďnatého). Na 100 ml absolutního alkoholu vezměte 1,2 g nátěru.
2. Roztok Azure I: Azur I - 1 g, šťavelan amonný - 0,4 g, chlorid sodný - 0,8 g, ethylalkohol 96% - 10 ml, destilovaná voda - 90 ml. Roztok barvy v uzavřené lahvičce se umístí na 2 až 3 dny do termostatu při 37 ° C a periodicky se silně protřepává. Potom se ochladí na teplotu místnosti a filtruje se přes filtrační papír. Roztok je uložen v misce z tmavého skla. Když se objeví sraženina, barva by měla být znovu přefiltrována.
3. Roztok Azure II: Azur II - 1 g, citrát sodný - 5 g, chlorid sodný - 0,4 g, destilovaná voda - 45 ml. Roztok se ponechá v termostatu při 37 ° C po dobu 2 dnů za občasného míchání. Pro urychlení rozpouštění může být barva zahřívána na nízké teplotě po dobu 15 až 20 minut bez varu. Ochlaďte na teplotu místnosti a přefiltrujte. Skladujte v misce z tmavého skla.

Speciální vybavení

Průběh stanovení

Barvení retikulocytů se provádí buď na skle nebo ve zkumavce.

Zbarvení retikulocytů na skle

Při barvení retikulocytů na skle se přes plamen hořáku zahřeje dobře promyté a odmastěné sklíčko. Pomocí skleněné tyčinky se na sklo nanese kapka jednoho z výše uvedených barviv a připraví se nátěr nátěru pomocí mletého skla. Se skleněným vláknem označujícím stranu skla, na které se nanáší nátěr barvy. V této formě může být sklo připraveno pro skladování a skladováno na suchém tmavém místě. Před analýzou se připraví vlhká komora. K tomuto účelu se obvykle používá Petriho miska s válečky navlhčenými vatou nebo filtračním papírem položeným podél okrajů. Na nátěr barvy naneste kapku krve, připravte z ní tenký nátěr a ihned ji umístěte na 3–10 minut do vlhké komory. Pak se usušily šmouhy ve vzduchu.

Zbarvení retikulocytů in vitro

Barva retikulocytů in vitro je odlišná při použití různých barviv.

Metoda 1 - barvení retikulocytů in vitro s kresyl brilantní modrou.

Před použitím se připraví pracovní roztok diamantové krezylové modři ve zkumavce na základě kapky 1% roztoku oxalátu draselného, ​​4 kapky barvy diamantové krystalové modři. K barvivu se přidá 0,04 ml krve (dvě pipety na značku 0,02). Směs se důkladně, ale opatrně míchá a nechá se 30 minut. Pak znovu promíchejte a připravte tenké tahy.

Metoda 2 - barvení retikulocytů in vitro azurem II.

Do zkumavky se vloží 0,05 ml roztoku barviva Azur II a 0,2 ml krve. Směs se důkladně promísí a nechá se 20 až 30 minut. Zamíchejte znovu a připravte tenké tahy.

Metoda 3 - barvení retikulocytů in vitro azurem I.

Do zkumavky se umístí 0,3 až 0,5 ml roztoku barviva Azur I a 5 až 6 kapek krve pipetou z aparátu Panchenkov. Zkumavka se uzavře pryžovou zátkou, směs se důkladně, ale opatrně promíchá a ponechá se po dobu 1–1,5 hodiny (retikulocyty se barví lépe, když jsou vystaveny 1,5–3 hodinám). Míchejte a připravte tenké tahy.

V současné době jsou komerčně dostupná hotová barviva pro tovární retikulocyty. Barvení retikulocytů s jejich pomocí se provádí podle přiloženého návodu.

Počítání retikulocytů.

Připravené jedním z výše uvedených způsobů se šmouhy mikroskopicky podrobí ponorné čočce. V nátěru jsou retikulocyty a erytrocyty zbarveny nažloutlezelenou granulární vláknitou látkou v retikulocytech - modré (pokud jsou obarveny azurovým II a kosočtvercovou modří) nebo modravě fialovou (pokud jsou barveny azurovým I).

Fotografie retikulocytů:

Najděte zorné pole, kde jsou červené krvinky umístěny odděleně. V těchto zorných polích je nutné počítat alespoň 1000 erytrocytů a zaznamenat mezi nimi počet erytrocytů obsahujících granulovanou vláknitou látku. Větší přesnost se dosáhne při výpočtu pro 2000 - 3000 červených krvinek.

Vzhledem k tomu, že velké množství červených krvinek je v zorném poli, což znesnadňuje jejich počítání, je nutné omezit (snížit) zorné pole. K tomu můžete použít buď speciální okulár, ve kterém můžete zmenšit zorné pole na požadovanou velikost, nebo použít speciální „okno“ (kruh s průměrem o něco menším, než je okulár oříznutý z papíru, ve středu kruhu se vyřízne malý diamant a výsledné okno se vloží do okuláru).

Počet spočítaných retikulocytů je vyjádřen v 100 (v procentech) nebo v 1000 (v ppm) erytrocytů.

Příklad: Při počítání v 1000 erytrocytových stěrech bylo zjištěno, že 15 z 1000 erytrocytů má granulovanou síť různých stupňů, to znamená, že se jedná o retikulocyty. V důsledku toho je počet retikulocytů v tomto případě 1,5% nebo 15.

Literatura:

• Referenční kniha "Laboratorní výzkumné metody v klinice", kterou napsal Menshikov VV - Moskva, "Medicine", 1987
• Lyubina A. Ya., Illicheva L. P. a spoluautoři - "Klinické laboratorní studie" - Moskva, "Medicína", 1984

Související články

Počítání počtu retikulocytů za použití fluorescenční mikroskopie

Metoda počítání počtu retikulocytů za použití fluorescenční mikroskopie je jednoduchá a vyžaduje málo času, přesnější než obvyklá metoda, protože fluorescenční mikroskopie odhaluje nejmenší zrna vláknité látky.

Sekce: Hemocytologie

Retikulocyt

Retikulocyty jsou mladé červené krvinky, které vznikají po ztrátě jader normoblasty. Charakteristickým rysem retikulocytů je přítomnost granulární substance (retikulum) v cytoplazmě, která představuje agregované ribozomy a mitochondrie.

Sekce: Hemocytologie

Patologické inkluze v červených krvinkách

Jolly Taurus (Howell-Jolly Taurus) - malé kulaté purpurově červené vměstky o velikosti 1 - 2 mikrony, vyskytující se 1 (méně často 2 - 3) v jednom erytrocytu. Představují zbytek jádra po odstranění jeho RES. Jsou detekovány při intenzivní hemolýze a "preloading" RES, po splenektomii, s megaloblastickou anémií.

Sekce: Hemocytologie

Cytochemická studie lipidů

Cytochemická studie lipidů je založena na použití barviv, která se rozpouštějí v tucích (Súdán III, Súdán IV, Černý Súdán atd.). Pro identifikaci neutrálního použití tuku Sudan III, barvení tuku oranžové. Lipoidy jsou lépe detekovány černou barvou Sudan (černé barvení).

Sekce: Cytochemie

Analýza moči podle Nechyporenka

Metoda Nechiporenko v domácí laboratorní diagnostice je nejběžnější metodou kvantitativního stanovení jednotných prvků v moči. Tato metoda je nejjednodušší, dostupná v jakékoliv laboratoři a vhodná v ambulantní praxi a má také několik výhod oproti jiným známým kvantitativním metodám pro studium sedimentů moči. Podle metody Nechyporenko určit počet vytvořených prvků (erytrocyty, leukocyty a válce) v 1 ml moči.

Sekce: Analýza moči

Metody počítání počtu retikulocytů

1. Spočítání počtu retikulocytů v nátěru po barvení speciálními barvivy.

2. Počítání počtu retikulocytů pomocí fluorescenční mikroskopie.

3. Automatické počítání retikulocytů pomocí hematologického analyzátoru.

Ve většině domácích laboratořích se počty retikulocytů provádějí v nátěru po barvení speciálními barvivy. Tato metoda je jednoduchá, ekonomická, nevyžaduje speciální drahé zařízení, a proto může být použita v jakékoliv klinické diagnostické laboratoři.

Druhá a třetí metoda pro počítání retikulocytů je také poměrně jednoduchá, ale z ekonomického hlediska mnohem dražší - vyžadují nákladné vybavení (fluorescenční mikroskop a hematologický analyzátor, který počítá retikulocyty) a činidla, a proto mohou být použity pouze v některých laboratořích.

Počet retikulocytů se stanoví mikroskopicky speciálně zbarvených nátěrů.

Jednotný způsob počítání počtu retikulocytů po jejich barvení kresyl brilantní modrou, azurovou I nebo azurovou II přímo na skle nebo ve zkumavce (1972).

- Princip Supravitální zbarvení barvivy, které odhaluje granulovanou vláknitou látku retikulocytů.

- Činidla. Můžete použít jedno z následujících barviv.

1. Nasycený roztok brilantní krezylové modři v absolutním alkoholu (pro přípravu absolutního alkoholu je nutné odolat 96% ethanolu při několika změnách kalcinovaného prášku síranu měďnatého). Na 100 ml absolutního alkoholu vezměte 1,2 g nátěru.

2. Roztok Azure I, navržený PN Korikov: azur 1 - 1 g, šťavelan amonný - 0,4 g, chlorid sodný - 0,8 g, ethanol 96% 10 ml, destilovaná voda - 90 ml. Roztok barvy v uzavřené lahvičce se umístí na 2-3 dny do termostatu při 37 ° C a periodicky silně protřepává. Potom se ochladí na teplotu místnosti a filtruje se přes filtrační papír. Roztok je uložen v misce z tmavého skla. Když se objeví sraženina, barva by měla být znovu přefiltrována.

3. Roztok Azur II následujícího složení: Azur II 1 g, citrát sodný 5 g, chlorid sodný, 0,4 g, destilovaná voda 45 ml. Roztok se ponechá v termostatu při 37 ° C po dobu 2 dnů za občasného míchání. Pro urychlení rozpouštění může být barva zahřívána na nízké teplotě po dobu 15 až 20 minut bez varu. Ochlaďte na pokojovou teplotu a přefiltrujte. Skladujte v misce z tmavého skla.

- Speciální vybavení. Mikroskop

Zbarvení na skle.

Dobře promyté a odtučněné sklíčko se zahřívá nad plamenem hořáku. Pomocí skleněné tyčinky se na sklo položí kapka jednoho z barviv a připraví se nátěr z mletého skla. Označte stranu skla, na které se nanáší nátěr, skleněným vláknitým grafem. V této formě může být sklo připraveno pro skladování a skladováno na suchém tmavém místě. Kapka krve se aplikuje na nátěr nátěru, připraví se z ní tenký nátěr a ihned se umístí do vlhké komory po dobu 3-4 minut (můžete použít Petriho misku s válečky navlhčenými bavlněnými nebo filtračními papíry na okrajích). Pak se usušily šmouhy ve vzduchu.

V takto připravených nátěrech jsou erytrocyty zbarveny do žlutozelené barvy, granulovaná látka je modrá.

Barvení in vitro.

Metoda 1: před použitím připravte zkušební roztok diamantu krezylové modři na zkumavku na základě kapky 1% roztoku oxalátu draselného 4 kapky roztoku barvy 1. Do barvy přidejte 0,04 ml krve (dvě pipety na značku 0,02). Směs se důkladně, ale opatrně míchá a nechá se 30 minut. Míchejte a připravte tenké tahy.

Metoda 2: 0,05 ml roztoku barvy 3 a 0,2 ml krve se umístí do zkumavky. Směs se důkladně promísí a nechá se 20 až 30 minut Míchejte a připravte tenké tahy.

Metoda 3: 0,3 až 0,5 ml roztoku barvy 2 a 5 až 6 kapek krve se umístí do zkumavky s pipetou z přístroje Panchenkov. Zkumavka se pokryje pryžovou zátkou, směs se důkladně, ale opatrně promíchá a nechá se po dobu 1-2 hodin (retikulocyty lépe obarvit s expozicí 2-3 hodiny). Míchejte a připravte tenké tahy.

U šmouh jsou erytrocyty zbarveny nažloutlezelenou, granulovanou vláknitou látkou v modré nebo modravě purpurové.

Připravené jedním z výše uvedených způsobů se šmouhy mikroskopicky podrobí ponorné čočce. Je nutné počítat nejméně 1000 červených krvinek a mezi nimi zaznamenat počet červených krvinek obsahujících granulovanou vláknitou látku. Prakticky pro větší přesnost použijte speciální okulár, ve kterém můžete zmenšit zorné pole na požadovanou velikost. S jednotnými tenkými tahy, ve kterých jsou červené krvinky uspořádány v jedné řadě, vybírají zorné pole, ve kterém je například 50 červených krvinek, a pak vypočítá 20 takových zorných polí. V nepřítomnosti hotového okuláru, to může být snadno připraveno odšroubováním okuláru 10X, vložením kusu papíru s malým čtvercem vyříznutým a šroubování to. Počet počítaných retikulocytů je vyjádřen na 1000 nebo na 100 erytrocytů.

Počítání počtu retikulocytů za použití fluorescenční mikroskopie.

- Princip Využití schopnosti látky retikulocytů fluoreskovat po léčbě krve akridinovou oranžovou.

1. Roztok akridinové pomeranče na isotonickém roztoku chloridu sodného a koncentraci 1: 5000. Pro přípravu isotonického roztoku se doporučuje použít destilovanou vodu o pH 5,8-6,8 Roztok akridinového pomeranče by měl být čerstvý; uchovávejte ji ne déle než 3-5 dnů v tmavé lahvičce se skleněnou zátkou.

2. Nefluorescenční imerzní olej. Lze použít afluol nebo běžný imerzní olej s fluorescencí zchlazenou nitrobenzenem (0,3 ml nitrobenzenu na 1 ml oleje). N. Zubzhitsky navrhuje použít jako nefluorescenční olej destilovaný anisol. Speciální vybavení. Mikroskop ultrafialový MUF-ZM nebo fluorescenční.

- Průběh odhodlání. Krev se smíchá s akridinovým pomerančem ve zkumavce nebo mixéru v poměru 1 díl krve a 10 dílů barvy (směs může být skladována ne déle než 5 hodin). Směs se míchá po dobu 2 minut, na skleněnou sklíčko se nanese kapka směsi a zakryje se krycím sklem. Mikroskop s použitím filtru ZhS-17. V preparátu, erytrocyty nefluoreskují a v retikulocytech granulární vláknitá látka svítí jasně červeně. Je známo, že v krvi stabilizované heparinem nebo citrátem sodným není pozorována fluorescence retikulocytů. Metoda je jednoduchá a vyžaduje trochu času; díky jasným luminiscencím se retikulocyty snadno počítají. Normální hodnoty. U zdravých jedinců je počet retikulocytů 2–12 ppm nebo 0,2–1,2%.

Počet retikulocytů v krvi odráží regenerační vlastnosti kostní dřeně a její hodnocení je široce používáno pro různé anémie (viz tabulka 24). Zvýšení počtu repkulotsitov pozorované po ztrátě krve, s hemolytickou anémií, zejména během krize (počet retikulocytů může být 20-30%), stejně jako léčba anémie s Addisonem Birmerem s vitaminem B12 (krize retikulocytů - počet retikulocytů se zvýšil o 4-8. Den léčba). Snížení počtu retikulocytů je charakteristické pro hypoplastickou anémii, recidivu Addison-Birmerovy anémie. Stanovení počtu retikulocytů může být použito pro stanovení tvorby erytropoézy a pro výpočet délky života červených krvinek.

HLAVNÍ STANICE VÝMĚNY ŽELEZA (DOPRAVA A VKLAD).

Železná doprava

• Transportní protein (b-1-globulin), glykoprotein,
• Přenáší Fe z gastrointestinálního traktu do erytrocyryocytů a tkáňových depotů (játra atd.).
• Normální hladina: 2,6 ± 0,05 g / l.
• Nasycení transferinu železem: 30-75%.
• Vstupuje do buňky endocytózou: zachycení komplexu Fe-transferinu buňkou.